Modyfikacje składu sztucznego podłożona (Basal Medium)

Skład sztucznego podłoża był przedmiotem licznych badań, zmierzających zarówno do jego uproszczenia, jak i do stworzenia lepszych warunków utrzymywania żywotności i ruchliwości krętka bladego in vitro. Podłoże opracowane przez Nelsona i Mayeraw 1948 r. zostało zmodyfikowane, w sposób przedstawiony w tab. 5-1, zarówno przez Nelsona i jego współpracowników, jak i innych badaczy, już w ciągu pierwszych lat po opracowaniu odczynu unieruchamiania krętków. Podłoże opracowane w 1951 r. przez Nelsona i Diesendrucka po wprowadzeniu pewnych z reguły nieznacznych modyfikacji jest stosowane przez większość pracowni nelsonowskich. Nieliczne tylko pracownie posługują się sztucznym podłożem, opracowanym na całkowicie odmiennych zasadach. Olansky, Portnoy i Harris, a także Doepfmer, oprócz wprowadzenia nieznacznych zmian w stosunkach ilościowych składników sztucznego podłoża zrezygnowali z ułtrafiltratu surowicy wołowej, który był przez Rice i Nelsona uważany za czynnik wpływający w sposób istotny na prze- żywalność krętków. W dalszych modyfikacjach część autorów wprowadziła w miejsce albuminy wołowej inne związki organiczne. Berlinghoff zamiast albuminy użył peristonu N, a Rietschel zastąpił albuminę 3% dekstranem, usuwając równocześnie z pożywki tioglikolan sodu, glutation, pirogronian sodu i wprowadził do sztucznego podłoża fruktozę. Hardy i Neli zamiast albuminy zastosowali 0,2% roztwór żelatyny. Pożywka według modyfikacji Hardy i Neli jest w Polsce stosowana przez Pracownię Nelsonowską we Wrocławiu. W modyfikacji opracowanej przez Boaka jako podłoża podstawowego użyto 50% roztworu inaktywowanej surowicy króliczej w fizjologicznym roztworze soli. Również Saurino wprowadzili do podłoża inaktywowaną surowicę króliczą, ludzką lub wołową, uważając, że odgrywa ona istotną rolę w przeżywalności krętków. Delacretaz opisał pożywkę zawierającą 5% wyciągu tkankowego zarodka myszy, 10% surowicy ludzkiej i 85% płynu Tyroda. Podobną pożywką posługiwali się Resta. Prócz tego wprowadzono szereg innych modyfikacji sztucznego podłoża, rzadziej używanych lub stosowanych w praktyce diagnostycznej. Znaczna większość pracowni nelsonowskich używa podłoża opracowanego przez Nelsona i Diesendrucka w modyfikacji opisanej przez Nielsena i stosowanej w Centralnym Ośrodku Serologicznym ŚOZ. W ostatnich latach do podłoża tego Fribourg-Blanc, a także Nielsen wprowadzili zamiast albuminy wołowej albuminę ludzką, uzyskując równie dobrą przeżywalność krętków. Przeżywalność krętków w zależności od składu podłoża sztucznego była przedmiotem badań Łosińskiego. Jak wynika z tych doświadczeń, najlepszą przeżywalność krętków zapewnia spośród badanych pożywek podłoże albuminowe wg modyfikacji Nielsena, a nieznacznie mu tylko ustępuje podłoże z żelatyną wg Haidy’ego i Neli. Mniej korzystne warunki przeżywalności stwarza podłoże Berlinghoffa, Rietschela, a przeżywalność krętków na i podłożu Boaka jest wyraźnie niedostateczna. W celu zapobieżenia zakażenia antygenu krętkowego innymi drobnoustrojami Ledbetter, Cannefax, a także Borel i Daguet — zaproponowali dodanie streptomycyny. Doświadczenie Pracowni Białostockiej dowodzi, że dodatek streptomycyny, proponowany przez Borela i Dagueta w ilości 1 mg/ml, zmniejsza niebezpieczeństwo wtórnego zakażenia antygenu krętkowego, nie upośledzając żywotności i ruchliwości krętków in vitro. Magnuson i Thompson, Borel, Bentejac i Durel oraz Ledbetter zaproponowali dodanie penicylinazy do pożywki podstawowej. Metoda ta zmniejsza odsetek surowic toksycznych, nie zapobiega jednak upośledzającemu przeżywalność krętków działaniu innych antybiotyków rozpowszechnionych w lecznictwie. W celu uproszczenia metodyki odczynu Nelsona niektórzy autorzy opracowali modyfikacje, polegające na zrezygnowaniu z mieszanki gazowej i stworzeniu warunków beztlenowych, koniecznych dla utrzymania krętków przy życiu, przy zastosowaniu innych metod. Owczynnikow zaproponował umieszczanie składników odczynu w mieszalnikach używanych do liczenia krwinek i opracował sposób ich uszczelnienia zakrętkami gumowymi. Utrillo i De Bravo uzyskiwali warunki beztlenowe zatapiając z obu stron probówki zawierające składniki odczynu Nelsona. Modyfikacje, w których można było zrezygnować z zastosowania mieszanki gazowej przez skrócenie okresu inkubacji, zostaną opisane w dalszej części niniejszego rozdziału. Ponieważ przygotowywanie sztucznego podłoża bezpośrednio przed wykonaniem odczynu zwiększa pracochłonność metody, Ajello oraz Fribourg-Blanc zaproponowali posługiwanie się sztucznym podłożem, przechowywanym w temperaturze zamrażarki przez okres kilku tygodni, a nawet kilku miesięcy. Metoda ta jest stosowana tylko przez nieliczne pracownie. Nie znalazło również szerszego zastosowania w praktyce podłoże liofilizowane, opisane przez Borela, Bentejac i Durela. Udoskonalenie i upowszechnienie podłoża liofilizowanego mogłoby odegrać istotną rolę w standaryzacji metodyki odczynu Nelsona.