Metodyka modyfikacji absorpcyjnej odczynu immunofluorescencji krętków

Modyfikacja absorpcyjna odczynu immunofluorescencji krętków (FTA-ABS) została opracowana w 1962 r. przez Hunter. Założenia teoretyczne tej modyfikacji zostały omówione w poprzedniej części niniejszego rozdziału. Stosowana początkowo przez Hunter technika FTA-ABS polegała na wstępnej absorpcji surowicy przeznaczonej do badania zagęszczoną zawiesiną krętków szczepu Reitera. Autorka rozcieńczała surowice zawiesina krętków w stosunku 1/5. Po 2 qodz. inkubacji w temp. 37° krętki odwirowywano. Dalszy sposób “wykonywania odczynu nie różnił się od metody oryginalnej OIFK. Ta technika została zmodyfikowana następnie przez Hunter, Deacona i Mayera. Autorzy ci do wstępnej absorpcji badanej surowicy używali krętków szczepu Reitera, poddanych działaniu ultradźwięków. Zastosowanie ultrasonatu krętków pozwoliło na uproszczenie techniki FTA-ABS F uzyskanie bardziej. powtarzalnych wyników. Sposób wykonywania modyfikacji absorpcyjnej odczynu immunofluorescencji krętków zostanie w niniejszym rozdziale opisany na podstawie doświadczeń własnych Pracowni Białostockiej, ponieważ technika FTA-ABS jest nadal przedmiotem badań licznych autorów zmierzających do udoskonalenia tego odczynu, omówione zostaną również ważniejsze modyfikacje FTA-ABS podane ostatnio w piśmiennictwie. W Pracowni Białostockiej używa się do wstępnej absorpcji badanej surowicy krętków szczepu Reitera poddanych działaniu ultradźwięków. Do hodowli krętków używa się pożywki produkcji Baltimore Biological Laboratories ,,BBL”, do której dodaje się unieczynnioną surowicę królika w ilości odpowiadającej 1/10 objętości pożywki. Świeże hodowle, wykazujące zwykle na 3 lub 4 dzień po pasażu obifty rozpleni krętków, a nie zawierające jeszcze aglutynatów ani form ziarnistych, odwirowuje się z szybkością 7000 r/min. Po 10-min. wirowaniu płyn znad osadu odlewa się, a do osadu krętków dodaje się buforowanego roztworu soli w takiej ilości, aby zawiesina krętków odpowiadała 1/50 początkowej objętości hodowli. Przygotowaną w ten sposób zawiesinę poddaje się działaniu ultradźwięków. Ultrasonat wiruje się z szybkością 1500 r/min. w celu usunięcia zanieczyszczeń i uzyskania klarownego, homogennego płynu. Badanie mikroskopowe nie powinno wykazywać w ultrasonacie żadnych morfologicznych elementów krętka. Po dodaniu mertiolatu w stosunku 1/10000 ultrasonat można przechowywać w lodówce przez okres wielu tygodni. Każda nowa seria ultrasonatu przeznaczonego do odczynu FTA-ABS poddawana jest miareczkowaniu w celu wykazania jego przydatności do odczynu FTA-ABS i oznaczenia jego optymalnego miana. Miareczkowanie przeprowadza się, oznaczając miano surowic kiłowych i badając surowice dające nieswoiście dodatnie wyniki OIFK. Za nadający się do stosowania uważa się taki ultrasonat, który użyty do wstępnej absorpcji nie zmniejsza w sposób wyraźny miana surowic kiłowych, a powoduje całkowitą negatywizację znanych surowic kontrolnych, dających wyniki nieswoiście dodatnie. W Pracowni Białostockiej modyfikację absorpcyjną odczynu immunofluorescencji wykonuje się zarówno metodą jakościową, jak i ilościową. W metodzie jakościowej odczynu FTA-ABS surowice badaną rozcieńcza się. w Pracowni Białostockiej nitrasonatem w stosunku 1/10. Dalsze etapy odczynu nie różnią się od jakościowego odczynu immunofluorescencji krętków wykonywanego według metody oryginalnej. Za wynik dodatni jakościowego odczynu FTA-ABS uważa się fluorescencję odpowiadającą ++. Od 1965 r. coraz więcej pracowni, głównie amerykańskich, używa innej metody — wstępnej absorpcji w odczynie FTA-ABS. Pracownie te wprowadziły odczynnik opisany przez Deacona i Stout, a produkowany i rozprowadzany drogą handlową przez kilka amerykańskich laboratoriów farmaceutycznych (BBL, Difco, Sylvana). Ostatnio stosowanie tego odczynnika zostało zalecone przez Pracownię VDRL w Atlanta, koordynującą badania nad odczynem FTA z inicjatywy SOZ. Zgodnie z opisem podanym przez Wooda i wsp. odczynnik ten uzyskuje się, poddając w autoklawie hodowlę krętków szczepu Reitera przez okres \ 20 min. działaniu temperatury 121°. Następnie hodowla ta jest przesączana) przez bibułę filtracyjną i odwirowywana z szybkością 22 000 r/min. Płyn znad | osadu odparowuje się do 1/30 pierwotnej objętości. Odczynnik uzyskiwany w ten sposób stosowany jest przez szereg autorów amerykańskich, między innymi przez Wooda i wsp., Bradforda i wsp., Beama i wsp.. Zdaniem Wooda zdolność absorpcji nieswoistych przeciwciał za pomocą „Sorbentu” odpowiada działaniu używanego poprzednio ultrasonatu, a stanowi znaczne uproszczenie i zmniejszenie kosztów odczynu FTA-ABS. Niel i Fribourg-Blancuzyskiwali z „Sorbentem” dostarczonym przez Deacona rezultaty gorsze niż z ultrasonatem. Badania nad udoskonaleniem modyfikacji absorpcyjnej odczynu immunofluorescencji są jeszcze dalekie od zakończenia, a metodyka FTA-ABS wymaga niewątpliwie standaryzacji. Odczyn ten stanowi jednak już obecnie, obok odczynu Nelsona, cenną metodą diagnostyczną, mającą istotne znaczenie dla weryfikacji serologicznego rozpoznawania kiły.

Author: mariuszlebek.pl